當前位置：首頁 > 技術文章 > biochain Z5030012說明書

biochain Z5030012說明書

更新時間：2020-07-21 點擊次數(shù)：2586

biochain Z5030012說明書

Malachite Green Phosphate Assay Kit

孔雀石綠磷酸鹽檢測試劑盒

總覽

BioChain的孔雀石綠磷酸鹽檢測試劑盒基于對孔雀石綠，鉬酸鹽和游離正磷酸鹽之間形成的綠色絡合物的定量分析。通過分光光度計（600 – 660 nm）或酶標儀可以方便地測量反應迅速形成的顏色。非放射性比色測定試劑盒已經(jīng)過優(yōu)化，可提供出色的靈敏度和更長的保存期限。該測定方法簡單，快速，只需一個添加步驟即可測定磷酸鹽。可以在試管，比色皿或多孔板中進行測定?？梢栽?6和384孔板中方便地進行測定，以高通量篩選酶抑制劑。

描述

BioChain的基于細胞的測定試劑盒可滿足制藥和生物技術客戶不斷增長的需求，這些需求源于從基因組學和蛋白質(zhì)組學衍生出來的大量藥物靶標。我們的客戶正在尋求在基于細胞的系統(tǒng)中進行大規(guī)模篩選，因為準確而完整的細胞數(shù)據(jù)很有希望并可以代表生物的生理狀況。該試劑盒配有用于該測定的所有試劑的完整系統(tǒng)和易于遵循的方案

孔雀綠磷酸鹽檢測試劑盒 (Z5030012)

孔雀綠磷酸鹽檢測試劑盒是基于對孔雀綠、鉬酸鹽和游離正磷酸鹽之間形成的綠色復合物進行定量。可在分光光度計 (600-660 nm) 或酶標儀上方便地測定反應快速顯色。對非放射性比色測定試劑盒進行了優(yōu)化，以提供*的靈敏度和延長的有效期。該測定法簡單、快速，涉及磷酸鹽測定的單個加入步驟。可在試管、比色皿或多孔板中執(zhí)行測定。該試驗可方便地在 96 孔和 384 孔板中進行，用于高通量篩選酶抑制劑。

關鍵特征

試劑非常穩(wěn)定。由于我們的創(chuàng)新配方，不會發(fā)生試劑沉淀。因此，測定前無需過濾試劑，這是其他市售試劑盒的常見要求。

高靈敏度和寬檢測范圍：檢測低至 1.6 pmole 的磷酸鹽，有效范圍為 0.02 M 至 40 M 磷酸鹽。

快速方便：均勻的“混合和測量”測定法可在 20 min 內(nèi)定量測定游離磷酸鹽。

與常規(guī)實驗室和 HTS 格式兼容：可在試管、比色皿或微孔板、分光光度計和酶標儀上進行測定。

在 96 孔和 384 孔板中觀察到穩(wěn)健且適用于 HTS：Z' 因子為 0.7-0.9?？稍?HTS 液體處理系統(tǒng)上輕松實現(xiàn)自動化。

應用

磷酸酶測定：從肽、蛋白質(zhì)或小分子底物中釋放磷酸鹽。

脂肪酶測定：從磷脂中釋放磷酸鹽

核苷三磷酸酶測定：從核苷三磷酸鹽（ATP、GTP、TTP、CTP 等）中釋放磷酸鹽。

磷脂、蛋白質(zhì)和 DNA 等中磷酸鹽的定量

藥物發(fā)現(xiàn)：高通量篩選磷酸酶抑制劑。

試劑盒內(nèi)容物：在 96 孔板中進行 2,500 次測定

試劑 A：50 mL 試劑 B：1 mL 標準品：1 mL 1 mM 磷酸鹽

儲存條件。試劑和標準品在 4 ℃ 下可穩(wěn)定儲存 1 年。

注意事項：試劑僅供研究使用。使用試劑時，應采取實驗室試劑的常規(guī)預防措施。詳細信息請參見材料安全數(shù)據(jù)表。

使用 96 孔板的程序

試劑制備。每次測定需要 20 L 工作試劑。通過混合 100 vol 試劑 A 和 1 vol 試劑 B（例如 5 mL 試劑 A 和 50 μL 試劑 B）制備足量的工作試劑。工作試劑在室溫下可穩(wěn)定儲存至少 1 天。

重要提示：使用前必須將試劑恢復至室溫。每次測定前，重要的是檢查所有酶制劑和測定緩沖液中均不含游離磷酸鹽。向 80µL 樣品溶液中加入 20µL 工作試劑可方便地完成該操作。在 620 nm 處的空白 OD 值應低于 0.2，如果 OD 讀數(shù)高于 0.2，檢查磷酸水水平。雙蒸水的 OD 讀數(shù)通常低于 0.1。實驗室清潔劑可能含有高水平的磷酸鹽。*清洗后，確保實驗室器具不污染磷酸鹽。

磷酸鹽標準品的制備。通過移取 40 L 1 mM 磷酸鹽標準品，置于 960 L 蒸餾水或酶反應緩沖液中，制備含 40 M 磷酸鹽的預混溶液。試管編號。

按下表所示稀釋標準品。移取 80 L 標準品，一式兩份，置于透明底 96 孔板的孔中。加入僅含水或反應緩沖液的空白對照。

No	預混劑 + H2O	終體積 (mL)	磷酸鹽濃度 (M)	pmoles 磷酸鹽 in 50 mL
1	200mL + 0mL	200	40	2,000
2	160mL + 40mL	200	32	1,600
3	120mL + 80mL	200	24	1,200
4	80mL + 120mL	200	16	800
5	60mL + 140mL	200	12	600
6	40mL + 160mL	200	8	400
7	20mL + 180mL	200	4	200
8	0mL + 200mL	200	0	0

2. 將 80µL 供試品轉(zhuǎn)移至平板的不同孔中。

注：在酶反應的情況下，可通過加入特定抑制劑終止反應，或通過加入工作試劑直接終止反應。試驗前可能需要稀釋反應混合物（見一般注意事項）。對于 ATP 酶或 GTP 酶測定，ATP 或 GTP 濃度應低于 0.25 mM，如果反應混合物含有 > 0.25 mM 的 ATP 或 GTP，則用蒸餾水稀釋樣品。例如，如果 ATP 酶反應含有 1 mM ATP，則在反應結(jié)束時，在測定前用水將反應混合物稀釋 4 倍。

向各孔中加入 20µL 工作試劑。輕敲微孔板輕輕混勻。

4. 室溫下孵育 30 min，顯色。

5. 在酶標儀上測定 600 nm-660 nm (620 nm) 處的吸光度。

對于 384 孔板中的測定，程序相同，只是標準品溶液和樣品溶液的體積應為 40 L，工作試劑的體積應為 10 L。

圖。96 孔板磷酸鹽標準曲線。孵育 30 min 后，讀取 620 nm 處的 OD。數(shù)據(jù)表示為平均 SD (n = 2)。有效檢測范圍為 0.02-40 M 磷酸鹽。

一般考慮

孵育時間。顯色反應在室溫下 30 min 內(nèi)完成。在 30 min 時讀取 OD 值。

在高濃度磷酸鹽 (> 100 M) 或存在高濃度蛋白質(zhì)和金屬（例如）的情況下，可能發(fā)生沉淀。

孔雀綠磷酸鹽檢測試劑盒

如果發(fā)生沉淀，在 H2O 中對樣品進行系列稀釋，運行試驗并測定無沉淀孔的稀釋因子。使用稀釋樣品重復測定。

酶反應緩沖液。由于任何外源性游離磷酸鹽均會干擾試驗，因此確保試驗中使用的蛋白制備液、反應緩沖液和實驗室器具不應含有游離磷酸鹽非常重要。這可以通過向緩沖液中加入工作試劑并測量顏色形成來方便地檢查。

液體處置。含量測定混合物含 0.4 M 硫酸。建議在處置前用等體積的 1 NNaOH 中和廢液。

數(shù)據(jù)分析

以 OD620 nm 對磷酸鹽標準品濃度作圖。根據(jù)標準曲線測定樣品磷酸鹽濃度。

文獻

Guérette,D. et al (2007)。VI 型中間絲蛋白的分子進化。BMC 進化生物學 2007,7:164.
Green,M.L. 等人 (2005)。乙二醇誘導大鼠高草酸尿癥，無代謝性酸中毒。Am JPhysiol Renal Physiol 289:F536–F543
Saran,D. 等人 (2006)。RNA 酶催化的多周轉(zhuǎn)硫代-ATP 水解酶和磷酸酶中間體形成活性。核酸研究，34 (11)：3201–3208。
Adkins,M.W. et al (2007)。PHO5 啟動子的染色質(zhì)拆卸對于招募一般轉(zhuǎn)錄機器和共激活因子至關重要。摩爾細胞生物學27:6372–6382.

高通量篩選

Rumsfeld J,Ziegelbauer K,Spaltmann F (2000) .以釀酒酵母和人胞質(zhì)酶為例，對無機焦磷酸酶進行高通量測定。蛋白表達純化18 (3) :303-9.
Cogan EB,Birrell GB,Griffith OH (1999) .基于機器人的無機和有機磷酸鹽自動化檢測。肛門生物化學271:29-35.
Ng DH,Harder KW,Clark-Lewis I,Jirik F,Johnson P (1995) .測定直接從細胞中分離的 CD45 蛋白酪氨酸磷酸酶活性的非放射性方法。J Immunol Methods.179 (2) :177-85.
Fisher DK,Higgins TJ (1994) .蛋白磷酸酶的靈敏、高容量比色法。藥學研究 11 (5) :759-63。

蛋白質(zhì)和 DNA 中的磷酸酶、脂肪酶/磷脂、核苷三磷酸酶和磷酸鹽分析

Harder KW,Owen P,Wong LK,Aebersold R,Clark-Lewis I,Jirik FR (1994) .使用合成磷酸肽對人蛋白酪氨酸磷酸酶 β (HPTPβ) 胞內(nèi)結(jié)構域進行表征和動力學分析。Biochem J. 298 (Pt 2) :395-401.
Queiroz-Claret C,Meunier JC (1993) .聚丙烯酰胺凝膠中磷酸酶的染色技術。肛門生物化學209 (2) :228-31.
Geladopoulos TP,Sotiroudis TG,Evangelopoulos AE (1991)?？兹妇G比色法測定蛋白磷酸酶活性。肛門生物化學192 (1) :112-6.
Samizo K,Ishikawa R,Nakamura A,Kohama K (2001)。通過反相高效液相色譜法測定肌球蛋白 atp 酶活性的高靈敏度方法。肛門生物化學293:212-5.
Hackney DD,Jiang W (2001) .驅(qū)動蛋白微管刺激的 atp 酶活性的測定。方法 Mol Biol.164:65-71.

岑 X，黃 Y，王 R，陳 Z，吳 Z (1998)?？兹妇G比色法同時測定成骨細胞大鼠 Ca (2 +)-atp 酶和 Na +、K (+)-atp 酶活性?；w益咳大補血寶。29 (4) :427-30.
Mahuren JD,Coburn SP,Slominski A,Wortsman J (2001)。磷酸鹽的微量測定法提供了使用生理、非顯色底物（如溶血磷脂酸）測定磷酸酶活性的通用方法。肛門生物化學298 (2) :241-5.
Cala SE (1999) .鈣網(wǎng)蛋白中假定含磷酸鹽肽的測定。生物化學生物物理學研究。259 (2) :233-8.
Gibson NJ,Newton CR,Little S (1997)。用于測量聚合酶鏈反應中擴增子積累的磷酸鹽比色法。肛門生物化學254 (1) :18-22.
Ekman P,Jager O (1993) .采用堿水解和孔雀綠定量測定磷蛋白中與絲氨酸和蘇?；鶜埢Y(jié)合的亞納摩爾量的磷酸鹽。肛門生物化學214:138-41.
Lu X,Pearson A,Lunec J (2003) .MYCN 癌蛋白作為藥物開發(fā)靶點。Cancer Lett.197 (1-2) :125-30.

臨床和一般診斷

Ohyama T,Matsubara C,Takamura K (1996) .靈敏密度測定法測定人淚液中血小板活化因子和其他磷脂。分析員121 (12) :1943-7.
Matsubara C,Ohyama T,Takamura K (1994)。采用硅膠板上的酶反應，通過密度測定法定量人唾液中的血小板活化因子和其他磷脂。Yakugaku Zasshi.114 (9) :681-90.
Kirchgesser M,Dahlmann N (1990)。酸性核苷三磷酸酶活性測定的比色法。臨床化學與生物化學雜志。28 (6) :407-11.
D'Angelo E,Crutchfield J,Vandiviere M (2001)?？焖佟㈧`敏、微量測定水和土壤中的磷酸鹽。環(huán)境質(zhì)量雜志。30 (6) :2206-2209.

技術說明

孔雀綠磷酸鹽檢測試劑盒已經(jīng)過優(yōu)化和配制，以提供靈敏、方便和穩(wěn)健的定量測定從酶反應和天然來源中釋放的游離磷酸鹽。試劑盒的關鍵特征如下：

試劑非常穩(wěn)定。由于我們的創(chuàng)新配方，不會發(fā)生試劑沉淀。因此，測定前無需過濾試劑，這是其他市售試劑盒的常見要求。

安全。非放射性試驗。

高靈敏度和寬檢測范圍：僅檢測 1.6 pmole 磷酸鹽和 0.02 M 至 40 M 磷酸鹽。